【课题套路】一文快速掌握最最最新热点研究思路

大家好，我是等国自然放榜等得花都谢了的无花果~（无花果好像不开花？）

最近胖师兄陆续给大家介绍了很多相分离这一热点的内容，有小伙伴就会说了，这个热点这么火，我要如何应用到自己的课题里呢？

今天就让我接替胖师兄，给大家说道说道这个听着很高大上的热点，该如何与我们平常的研究相结合。

这篇最近发表于nature cell biology (IF=20.042) 上的文章就发现了内胚层分化过程中，lncRNA DIGIT通过招募和结合BRD3蛋白使其形成相分离，从而稳定BRD3与H3K18ac位点的结合，促进下游基因的转录。（是不是感到陌生又熟悉？没错！BRD3就是胖师兄上次相分离推文里的主角——BRD4的近亲，详情请戳→【热点追踪】百炼钢化作绕指柔~~解析相分离（二））

先简单介绍一下背景：

BET家族下的BRD2、3、4蛋白在发育过程中有非常关键的作用，它们具有的溴区结构域（bromodomain）可以结合乙酰化组蛋白，外终端区（ET domain）能够结合转录因子、激活子等，调控基因的转录。简单说来，BRD就是个中介（mei po），可以把一些调控转录的蛋白招募到DNA上。它们有多重要呢？完全敲除BRD4导致小鼠胚胎致死，完全敲除BRD2导致胚胎发育9-10天左右致死。因此，解析BRD蛋白对基因的调控模式有助于我们更深入了解胚胎发育的调控。

这篇文章的作者和我们平时的研究思路差不多，第一步是从lncRNA（DIGIT）入手，想看看它能结合哪些蛋白。用的是类似于RNA-pull down的实验，然后去打了个质谱。结果发现BRD3的评分最高。为了验证这一结果，又做了一个RIP，证明BRD3同样大量结合DIGIT。 

然后就用分子实验验证一下DIGIT于BRD3的结合位点以及结合特异性是很高的，这里就不赘述了。

第二步当然是看看两者在细胞内的结合具体是什么样的（比如在什么地方，什么时间结合）。作者分别在DIGIT和BRD3后面接了不同颜色的荧光蛋白，在显微镜下观察两者的活动轨迹。

结果是很amazing啊，BRD3在核内竟然不是一片分布的，而是一个个亮点。DIGIT的荧光也是与那些点重合的。然后看看BRD4（也就是之前研究发现有相分离现象的兄弟），再细胞内的表达模式和BRD3一样一样的。然后作者就想到，BRD3是不是也相分离？用荧光漂白那一套来一遍，发现确实没错。

然而关键是DIGIT有什么用呢？于是作者在体外用相分离的研究方法做了一下，发现有了DIGIT就能出现相分离，没有就不能。

做到这里，大家会说，这些我也可以做啊，为啥他能发这么高分？

那就说到重点了，简单的现象观察当然没什么特别，关键是要结合生物学意义啊！！！

作者就通过一系列实验（此处省略一千字），发现BRD3结合H3K18ac（组蛋白3赖氨酸18乙酰化）位点，当敲除BRD3，此处位点调控的下游发育相关的关键基因表达就显著下降。

作者又做了ChIPseq统计了一下BRD3结合H3K18ac调控的所有下游基因表达，进一步验证DIGIT招募BRD3至基因调控位点，产生相分离促进下游基因的转录。有兴趣的小伙伴可以自己看文章。（这里就说明了想要发好文章，生物学意义是关键）

最后，根据这些结果，提出以下模型：LncRNA DIGIT结合BRD3促进其相分离，靠近H3K18ac位点，调控下游靶基因的转录。 

文章思路：

总结：

其实这篇文章的思路比较简单清晰，没有什么弯弯绕绕。使用的实验方法也是我们平时研究中都会用到的RNA-pull down、RIP、ChIP等技术。然而能够将热点lncRNA、BRD3的相分离以及组蛋白的修饰结合起来，加上一些分子机制的探究，把上下游都说清楚了就已经很完整。相分离只是一个切入点，关键是为什么？（也就是生物学意义）

如果说这篇文章有什么缺点的话，文中的相分离主角基因是BRD3，从创新角度有所欠缺。不过由于这一热点刚开始起步，在疾病中的研究尚不多，因此可以先从这一家族的蛋白入手。

这篇文章研究的是内胚层发育过程中的相分离调控，延展到我们自己的课题，可以把内胚层发育换成疾病，比如肿瘤增殖转移等等，然后可以走两种思路：
A. 模仿作者的思路先找到候选lncRNA以及它的结合蛋白，预测和观察互作蛋白是否有相分离现象；

B. 如果就是想联系相分离热点，也可以从已知有相分离的蛋白（比如BRD家族）入手，先观察其对疾病的影响，再向上游找调控因子，向下游找可与疾病表型相关联的通路。

注：此推文未经许可禁止转载！

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