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【课题套路】一文快速掌握最最最新热点研究思路

无花果 科研讲坛 2021-02-21
大家好,我是等国自然放榜等得花都谢了的无花果~无花果好像不开花?
最近胖师兄陆续给大家介绍了很多相分离这一热点的内容,有小伙伴就会说了,这个热点这么火,我要如何应用到自己的课题里呢
今天就让我接替胖师兄,给大家说道说道这个听着很高大上的热点,该如何与我们平常的研究相结合。


这篇最近发表于nature cell biology (IF=20.042) 上的文章就发现了内胚层分化过程中,lncRNA DIGIT通过招募和结合BRD3蛋白使其形成相分离,从而稳定BRD3与H3K18ac位点的结合,促进下游基因的转录。是不是感到陌生又熟悉?没错!BRD3就是胖师兄上次相分离推文里的主角——BRD4的近亲,详情请戳→【热点追踪】百炼钢化作绕指柔~~解析相分离(二)

先简单介绍一下背景
BET家族下的BRD2、3、4蛋白在发育过程中有非常关键的作用,它们具有的溴区结构域(bromodomain)可以结合乙酰化组蛋白,外终端区(ET domain)能够结合转录因子、激活子等,调控基因的转录。简单说来,BRD就是个中介(mei po),可以把一些调控转录的蛋白招募到DNA上。它们有多重要呢?完全敲除BRD4导致小鼠胚胎致死,完全敲除BRD2导致胚胎发育9-10天左右致死。因此,解析BRD蛋白对基因的调控模式有助于我们更深入了解胚胎发育的调控。

这篇文章的作者和我们平时的研究思路差不多,第一步是从lncRNA(DIGIT)入手,想看看它能结合哪些蛋白。用的是类似于RNA-pull down的实验,然后去打了个质谱。结果发现BRD3的评分最高。为了验证这一结果,又做了一个RIP,证明BRD3同样大量结合DIGIT。 


然后就用分子实验验证一下DIGIT于BRD3的结合位点以及结合特异性是很高的,这里就不赘述了。
第二步当然是看看两者在细胞内的结合具体是什么样的(比如在什么地方,什么时间结合)。作者分别在DIGIT和BRD3后面接了不同颜色的荧光蛋白,在显微镜下观察两者的活动轨迹。
结果是很amazing啊,BRD3在核内竟然不是一片分布的,而是一个个亮点。DIGIT的荧光也是与那些点重合的。然后看看BRD4(也就是之前研究发现有相分离现象的兄弟),再细胞内的表达模式和BRD3一样一样的。然后作者就想到,BRD3是不是也相分离?用荧光漂白那一套来一遍,发现确实没错。


然而关键是DIGIT有什么用呢?于是作者在体外用相分离的研究方法做了一下,发现有了DIGIT就能出现相分离,没有就不能。

 
做到这里,大家会说,这些我也可以做啊,为啥他能发这么高分?
那就说到重点了,简单的现象观察当然没什么特别,关键是要结合生物学意义啊!!!
作者就通过一系列实验(此处省略一千字),发现BRD3结合H3K18ac(组蛋白3赖氨酸18乙酰化)位点,当敲除BRD3,此处位点调控的下游发育相关的关键基因表达就显著下降。

作者又做了ChIPseq统计了一下BRD3结合H3K18ac调控的所有下游基因表达,进一步验证DIGIT招募BRD3至基因调控位点,产生相分离促进下游基因的转录。有兴趣的小伙伴可以自己看文章。(这里就说明了想要发好文章,生物学意义是关键)
最后,根据这些结果,提出以下模型:LncRNA DIGIT结合BRD3促进其相分离,靠近H3K18ac位点,调控下游靶基因的转录。 

 
文章思路:


总结:
其实这篇文章的思路比较简单清晰,没有什么弯弯绕绕。使用的实验方法也是我们平时研究中都会用到的RNA-pull down、RIP、ChIP等技术。然而能够将热点lncRNA、BRD3的相分离以及组蛋白的修饰结合起来,加上一些分子机制的探究,把上下游都说清楚了就已经很完整。相分离只是一个切入点,关键是为什么?也就是生物学意义
如果说这篇文章有什么缺点的话,文中的相分离主角基因是BRD3,从创新角度有所欠缺。不过由于这一热点刚开始起步,在疾病中的研究尚不多,因此可以先从这一家族的蛋白入手。
这篇文章研究的是内胚层发育过程中的相分离调控,延展到我们自己的课题,可以把内胚层发育换成疾病,比如肿瘤增殖转移等等,然后可以走两种思路
A. 模仿作者的思路先找到候选lncRNA以及它的结合蛋白,预测和观察互作蛋白是否有相分离现象;
B. 如果就是想联系相分离热点,也可以从已知有相分离的蛋白(比如BRD家族)入手,先观察其对疾病的影响,再向上游找调控因子,向下游找可与疾病表型相关联的通路。
 

注:此推文未经许可禁止转载!


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